Institut für Klinische Physiologie

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  Hans Ebel
Forschungsthemen

Projekte 1.  Regulation von Natrium-abhängigem Soluttransport durch physiko-chemische Parameter 2.  Magnesium-Transport      -  Transmembranaler Magnesium-Transport      -  Transepithelialer Magnesium-Transport   Methoden -  Messung von Transporten an isolierten Bürstensaum-Membranvesikeln -  Messung von Transporten an intakten Erythrocyten   Publikationen

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Projekte

1. Regulation von Na⁺-abhängigem Soluttransport durch physiko-chemische Parameter

Ziel der Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe ist die Frage, inwieweit der Na⁺-abhängige Soluttransport in Bürstensaummembranen von Epithelien, z.B. von Niere und Darm durch physiko-chemische Parameter wie Membranfluidität und Membranoberflächenladung reguliert werden kann. In früheren Untersuchungen hatten wir gezeigt, daß der Na⁺-D-Glucose-Transport von Bürstensaummembran Vesikeln aus Darm und Niere eng mit der Membranfluidität verknüpft ist: Eine Zunahme der Membranfluidität durch den Einbau von langkettigen ungesättigten Fettsäuren (LCUFA, Prototyp Oleat) bewirkt offensichtlich über eine Konformationsänderung des Transporterproteins eine Abnahme des Na⁺-abhängigen D-Glucosetransports aber eine Zunahme des Na⁺/H⁺-Austausches. Außerdem ist eine trans Na⁺-Hemmung (auf der Membraninnenseite) beteiligt.

Die gegenwärtigen Untersuchungen befassen sich mit zwei Fragestellungen.

• Spezifität des LCUFA-Effektes: Es soll geklärt werden, ob nur der Na⁺-abhängige D-Glucose-Transport oder auch andere Na⁺-abhängige und Na⁺-unabhängige Transporter für Zucker, Carboxylsäuren und Aminosäuren gehemmt werden.
• Bedeutung der Membranoberflächenladung: Die Membranoberflächenladung soll durch Einbau von Phospholipiden mit neutraler, positiver und negativer Kopfgruppenladung variiert werden, wobei zuätzlich noch der Effekt verschiedener Acylreste (gesättigte und ungesättigte Fettsäuren mit unterschiedlich langen Ketten) mituntersucht wird.
  

2. Mg²⁺-Transport

Transmembranaler Mg²⁺-Transport

Über den Mechanismus des transmembranalen und transepithelialen Transportes von Mg²⁺ ist im Vergleich zu Na⁺ und K⁺ wenig bekannt. Dies liegt zum Teil daran, daß die meisten Zellen einen ziemlich geringen Austausch ihres Mg²⁺ haben und dieses nur abgeben, wenn durch Zerfall von ATP oder aus anderen Gründen die intrazelluläre freie Mg²⁺-Konzentration über den Normalwert ansteigt. An menschlichen Erythrocyten als Modellzelle für transmembranlen Mg²⁺-Transport sind unter physiologischen Bedingungen die meßbaren Mg²⁺-Ausflußraten nur klein; daher war es zum Erhalt von gut meßbaren Mg²⁺-Ausstromraten notwendig, diese massiv mit Mg²⁺ zu beladen. Dabei blieb unklar, ob der unter diesen Bedingungen zustande kommende Mg²⁺-Efflux den gleichen Mechanismen unterliegt wie unter physiologischen Bedingungen. Bisher wurde an Mg²⁺-beladenen menschlichen Erythrocyten gefunden, daß ein Teil des Mg²⁺ (rund 30%) über den Na⁺/Mg²⁺-Antiport transportiert wird, der aber nur in seinen Grundzügen charakterisiert wurde. Über den Mechanismus des Na⁺-unabhängigen Mg²⁺-Transports an diesen Mg²⁺-beladenen Zellen ist kaum etwas bekannt.

Die eigenen Untersuchungen haben zum Ziel, den Mechanismus des Mg²⁺-Auswärtstransportes und hier insbesonderen den Na⁺-unabhängigen Mg²⁺-Transport an Rattenerythrocyten zu untersuchen und mit dem von menschlichen Erythrocyten zu vergleichen. Die Erythrocyten von Ratten haben einen etwa 50 mal höheren Mg²⁺-Auswärtstransport als menschliche Erythrocyten, so daß auf die Mg²⁺-Beladung verzichtet werden kann, die möglicherweise über eine allosterische Konformationsänderung zu einer ganz wesentlichen Änderung der Eigenschaften des Mg²⁺-transportierenden Prozesses führt.

Transepithelialer Mg²⁺-Transport

In resorbierenden Epithelien wie Darm und Niere kann Mg²⁺ wie auch andere Solute passiv durch die tight junctions, aber in bestimmten Segmenten (Ileum, Colon im Darm und dicke aufsteigende Henle-Schleife in der Niere) wahrscheinlich auch transmembranal aufgenommen werden. In der Niere gibt es fundierte Hinweise auf einen transmembranalen, elektrogenen und Na⁺-unabhängigen Mg²⁺-Transport durch einen Kanal.

Am Darm ist es umstritten, ob Mg²⁺ ausschließlich über die tight junctions oder auch transmembranal aufgenommen wird. Wir haben an isolierten Bürstensaummembranen aus dem Kaninchen-Ileum zeigen können, daß es einen sättigbaren, elektroneutralen und anionensensitiven Mg²⁺-Transport gibt. Offen blieb, ob der Mg²⁺-Transport über ein Carrier oder durch einen Kanal erfolgt und welche Rolle die Anionen hierbei spielen.

Ziel der weiterführenden Untersuchungen der Arbeitsgruppe ist es, an isolierten Bürstensaummembranen des Kaninchen-Ileums den Einfluß von Anionen und damit verbunden auch von Protonen auf den Mg²⁺-Transportmechanismus näher zu charakterisieren. Da Mg²⁺ ähnlich wie Ca²⁺ wegen seiner starken positiven Ladung an negative Ladungen der Membranoberfläche bindet, kann man zur Untersuchung des Transportes nicht das gesamte Mg²⁺ z.B. mit der Atomabsorptionsmethode bestimmen. Stattdessen ist es notwendig, das freie Mg²⁺ intravesikulär zu bestimmen. Dies geht mit einer fluorometrischen Zwei-Wellenlängenmethode mit Mg-Fura2. Diese an intakten Zellen in vivo mittlerweile etablierte Methode wurde von uns erstmals auf isolierte Bürstensaummembranen in vitro erfolgreich übertragen.

Methoden

Messung von Transporten an isolierten Bürstensaum-Membranvesikeln von Dünndarm und Nierenrinde

• Isolierung der Bürstensaummembranen mit MgCl₂-Präzipitation und Differentialzentrifugation
• Messung von Na⁺-abhängigen Soluttransporten mit ³H- und/oder ¹⁴C-markierten Soluten und Schnellfiltrationsmethode
• Messung von Mg²⁺-Transport an Bürstenaummembranen durch fluorometrische Bestimmung des intravesikulären freien Mg²⁺ mit der Mag-Fura2-Methode (Zweiwellenlängen-Methode)
• Variation verschiedener von außen nach innen oder innen nach außen gerichteter Kationen-, Anionen- und Protonengradienten
• Variation der Membran-Ladung, -Dicke, -Fluidität durch Einbau von verschieden geladenen Phopsholipiden mit verschieden langen und verschieden gesättigten Acylresten
• Messen der Membranfluidität mit der Fluoreszendepolarisation mit Sonden für verschiedene Membranregionen (DPH, 12-AS)
• Messen des Membranoberflächen-Potentials mit der Merocyanin-und DiSC₃(5)-Fluoreszenzmethode
• Messen des intravesikulären pH mit der BCECF- und SNARF-Fluoreszenzmethode

Messung von Transporten an intakten Erythrocyten

• Verwenden von intakten Erythrocyten verschiedener Species
• Messen des Mg²⁺-Effluxes in Mg²⁺-freies Medium bei nicht Mg²⁺-beladenen und Mg²⁺-beladenen Erythrocyten
• Differenzieren zwischen Na⁺-abhängigen und Na⁺-unabhängigem Mg²⁺-Efflux in verschiedenen Medien mit hoher und niedriger Ionenstärke
• Variation der extrazellären Kationen-, Anionen- und Protonen-Gradienten
• Variation der intrazellulären Kationen-, Anionen- und Protonengradienten sowie des Membranpotentials nach Verarmung und gezielter Beladung