Institut für Klinische Physiologie

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  Unser Forschungskonzept !

 

   
Tight junctions, Kanäle, Carrier  Forschungsthemen
- Tight junction-Proteine: Claudin-1 bis -24, Occludin und Tricellulin
- Barrieredefekt bei Colitis ulcerosa und M. Crohn
- Entzündungsmediatoren Tumornekroesfaktor alpha und Interleukine

- Epitheliale Apoptosen verursachen Lecks
- Wundheilung / Restitution epithelialer Einzelzelldefekte
- Direkte Messung der Durchlässigkeit des parazellulären Weges
- Lokalisierung von Ionenkanälen in Krypten und Oberflächenepithel

- Epithelialer Na+-Kanal (ENaC)

- Magnesium

- Physiologie des Auges
- Glaukom
- Netzhautdegenerationen
Krankheiten, die wir erforschen
Info für Betroffene und Interessierte
cartoonMethoden
- Molekularbiologische Methoden
- Fluoreszenzoptische Lokalisierung
- Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie
- Kurzschlussstrom in Ussing-Kammern
- Conductance scanning
- Impedanz-Spektroskopie
- Patch clamp
cartoon Einige Begriffe
- Epithelien
- Die Zellinie HT-29/B6
- Leckflux-Diarrhoe
- Apoptose im Kolonepithel (HT-29/B6)
- Tutorial (A.H. Gitter): Elektrische Impedanz von Epithelien
Abgeschlossene Projekte

  Unser Forschungskonzept  

Physiologen wollen immer wissen: Wie funktioniert es?
  • Physiologie ist keine bestimmte Methode, sondern eine besondere Art der Fragestellung: Wir benutzen ein weites Spektrum von Methoden - immer mit dem Ziel, die Frage "Wie funktioniert es?" jeweils für die von uns untersuchten Moleküle, Zellen, Organe oder den ganzen Körper zu beanworten.
  • Basis des Verständnisses von Krankheiten ist die Kenntnis der Funktionen beim Gesunden. Wir untersuchen daher sowohl die normalen Funktionen als auch - mit den gleichen Methoden - die veränderten Funktionen bei Krankheitszuständen.
  • Untersuchungsobjekt sind isolierte Epithelien und Zellkulturen. In diesem thematischen Spektrum hat sich eine langjährige und sehr erfolgreiche Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Jörg-Dieter Schulzke, Allgemeinmedizin sowie Gastroenterologie, entwickelt.

Wir kombinieren molekularbiologische, physiologische und mikroskopische Techniken
  • Mit elektrophysiologischen oder physikalischen Methoden allein kann man die Frage "Wie funktioniert es?" nicht hinreichend beantworten, solange die molekulare Struktur unbekannt bleibt. 
  • Allerdings vermittelt auch die Erforschung der molekularen Struktur allein noch keine Einsicht in den Funktionsablauf der Gesamtzelle bzw. des Körpers.
  • Wir kombinieren daher in unseren Projekten funktionelle (= zumeist elektrophysiologische) und strukturelle (= molekularbiologische, biochemische und Fluoreszenz-mikroskopische, elektronenmikroskopische) Techniken.

Hauptthema ist die Tight Junction

Mit molekularbiologischen und Fluoreszenz-mikroskopischen Methoden untersuchen wir die Rolle der Tight junction-Proteine der Claudin-Familie sowie Occludin und Tricellulin und korrelieren die Ergebnisse mit elektrophysiologischen Messungen. Hierfür haben wir zwei spezielle Techniken entwickelt:

Bei entzündlichen Darmerkrankungen (Colitis ulcerosa und Morbus Crohn) verursachen Zytokine wie Tumornekrosefaktor alpha (TNFa) eine starke Durchlässigkeitszunahme der Tight junctions. Die Schädigung der intestinalen Barriere verursacht eine Leckflux-Diarrhoe sowie eine unerwünschte Aufnahme von Darminhalt und trägt so wesentlich zum Krankheitsprozess bei. 

Nicht weniger wichtig sind die Transporter der Zellmembran

Tight junctions, Kanäle, Carrier
Forschungsthemen 

Tight junction-Proteine: Claudin-1 bis -24, Occludin und Tricellulin

Tight junctions bestehen aus den transmembranalen Proteinen Claudin-1 bis -24, sowie Occludin und Tricellulin. Als strukturelle Gemeinsamkeit besitzen sie 4 transmembranale Regionen und 2 extrazelluläre Schleifen. Sie haben bezüglich der Barrierebildung sehr unterschiedliche Funktionen: Viele dichten ab, während einige andere sogar das Gegenteil bewirken, indem sie parazellulär verlaufende Kanäle bilden (Claudin-2, -7, -16).
Zu den TJ-Proteinen zählt auch JAM, das junctional adhesion molecule, das einen transmembranalen Durchgang aufweist.

2009: 2012: parts I and II

Allgemeine Reviews über Tight Junction-Proteine:

Demnächst:

 

Es gibt zwei Familien von Tight Junction-Proteinen mit vier transmembranären Domänen (Tetraspan-Proteine):

Ein weiteres Protein der Tight Junction ist JAM (Junctional Adhesion Molecule). Es besitzt eine transmembranäre Domäne. JAM vermittelt mechanischen Zusammenhalt zwischen benachbarten Zellmembranen, besitzt aber keine Barrierefunktion.
Nicht zu den transmembranären Tight Junction-Proteinen gehören zahlreiche Gerüstproteine (scaffold proteins) wie z.B. ZO-1 und ZO-2 (Zonula Occludens-1 und -2). Sie verbinden die meisten Claudine und die TAMPs mit dem Zytoskelett.

Claudin-Familie
Allgemein: Zur Zeit sind 24 verschiedene Claudine bekannt. Ein wesentliches Forschungsziel ist, die funktionellen Eigenschaften der einzelnen Claudine bei der Barriere- und Kanalbildung der Tight junction aufzuklären. Es stehen noch nicht für alle Claudine Antikörper zur Verfügung. Ein typischer Arbeitsansatz besteht darin, hochohmige oder niederohmige Madin-Darby canine kidney-Zellen (MDCK) mit der cDNA eines Claudins zu transfizieren, die Lokalisation in der Tight junction fluoreszenzoptisch zu verifizieren und dann die veränderten Barriere- oder Kanaleigenschaften elektrophysiologisch zu charakterisieren. 

Claudin-1
Lokalisation: Typisch für Epithelien mit fast undurchlässigen Tight junctions ("dichte Epithelien") wie Dickdarm, distaler Nierentubulus und Epidermis
Funktion: Parazelluläre Barriere für transepitheliale Diffusion
Klinische Bedeutung: Claudin-1 ist vermindert exprimiert bei hereditären Formen von Brustkrebs. Ein Claudin-1-Defekt liegt bei der mit Ichthyosis assoziierten neonatalen sklerosierenden Cholangitis vor. Vermehrt exprimiert sind dagegen Claudin-1 und Claudin-4 bei colorektalen Tumoren sowie bei Pankreas- und ovarialen Tumoren. Claudin-1 ist entscheidend für die parazelluläre Barriere in der menschlichen Epidermis

Claudin-2
Lokalisation: Typisch für Epithelien mit relativ durchlässigen Tight junctions ("lecke Epithelien") wie Dünndarm und proximaler Nierentubulus
Funktion: Wir konnten zeigen, dass Claudin-2 einen extrazellulär verlaufenden Kanal für kleine Kationen bildet (Amasheh et al. 2002)
               Neu:  ... und auch für Wasser (Rosenthal et al. 2010).
Klinische Bedeutung: Vermehrte Expression führt zur verminderten Barrierefunktion 

Claudin-3 (=RVP1)
Lokalisation: Typisch für dichte Epithelien
Funktion: Wir konnten zeigen, dass Claudin-3 ein barrierebildendes TJ-Protein ist, das gegen Ionen (und zwar für Kationen und Anionen gleichermaßen) und ungeladene größere Solute abdichtet.
Klinische Bedeutung: Claudin-3 und -4 sind Rezeptoren für das Enterotoxin von Clostridium perfringens.

Claudin-4
Lokalisation: Typisch für dichte Epithelien
Funktion: Parazelluläre Barriere
Klinische Bedeutung: Beim Williams-Beuren-Syndrom wird Claudin-4 nicht exprimiert.

Claudin-5
Lokalisation:  Typisch für Endothelien, jedoch wird es auch in machen Epithelien exprimiert.
Funktion: Wir konnten zeigen, dass es zu den abdichtenden Claudinen gehört, sowie dass es auch bei Epithelien exprimiert sein kann.
Klinische Bedeutung: Beim Velo-cardio-fazialen Syndrom (DiGeorge-Syndrom) liegt ein Claudin-5-Defekt vor und es kommt zu einem Zusammenbruch der Blut-Hirnschranke.

Claudin-6
Lokalisation: Embryonale Epithelien, Fettgewebe
Funktion: Überexpression von Claudin 6 hemmt die Expression anderer Claudine und verursacht eine schwere Barrierestörung

Claudin-7
Lokalisation: Niere: Distales Nephron
Funktion: Die Funktion von Claudin-7 ist umstritten. In LLC-PK1-Zellen (einer renalen Anionen-selektiven Zelllinie) fanden Alexandre et al. 2005 eine verminderte Cl--Leitfähigkeit (und gesteigerte Na+-Leitfähigkeit) und Hou et al. 2006 eine erhöhte Cl--Leitfähigkeit. In MDCK-II-Zellen zeigten Alexandre et al. 2005 keine Änderungen durch Claudin-7, während Hou et al. 2006 in MDCK II-Zellen keine Veränderung der Cl--Leitfähigkeit, aber eine Abnahme der Na+-Leitfähigkeit fanden. Die Eigenschaften von Claudin-7 sind somit offenbar Zelltyp-abhängig - jedenfalls kann Claudin-7 nach unserer Einschätzung derzeit nicht generell als Kanal-Bildner bezeichnet werden. 

Claudin-8
Lokalisation: Niere: Aldosterone-sensitives distales Nephron (ASDN)
Funktion: Barriere für Kationen in dichten Epithelien.

Claudin-9
Lokalisation: Auge: Cornea-Epithel, Ohr: Innenohr

Claudin-10
Lokalisation: Claudin-10 existiert in sechs Splice-Varianten. Zwei davon sind funktionell bedeutsam: Claudin-10a (lokalisiert in Nierentubului) und Claudin-10b (lokalisiert in vielen Epithelien einschließlich Nierentubuli)
Funktion: Claudin-10a ist Anionen-permeabel. Claudin-10b bildet einen Kationenkanal, ist aber, im Gegensatz zu Claudin-2, nicht permeabel für Wasser

Claudin-11 (= OSP)
Lokalisation: ZNS: Oligodendrocyten, Testis: Sertoli-Zellen, Ohr: Corti-Organ, Niere: prox. Tubulus, Henle-Schleife
Funktion: Barriere

Claudin-12
Lokalisation: Duodenum, Jejunum, Ileum, Colon, Harnblase, Epidermis

Claudin-13
Lokalisation: Duodenum, Jejunum, Ileum, Colon

Claudin-14
Lokalisation: Ohr: Cochlea-Haarzellen; Niere: Sammelrohr, Auge: Cornea-Epithel
Funktion: Barriere

Claudin-15
Lokalisation: Darmepithel
Funktion: Kationenkanal

Claudin-16 (= Paracellin-1)
Lokalisation: Niere: Dicker aufsteigender Teil der Henle-Schleife, distaler Tubulus
Funktion: Claudin-16 ist an der Resorption von Magnesium und Calcium beteiligt
Klinische Bedeutung: Mutationen von Claudin-16 führen zu hereditärer Hypomagnesiämie mit Hyperkalziurie und Nephrokalzinose (FHHNC)

Claudin-17
Lokalisation: Niere, hier haupsächlich proximaler Tubulus, nach distal hin abnehmend. Geringfügig im Gehirn.
Funktion: Parazellulärer Kanal für Anionen (Erstbeschreibung dieser Funktion und der Lokalisation: Krug et al. 2012a). Chlorid wird im proximalen Tubulus zum erheblichen Anteil parazellulär resorbiert. Claudin-17 ist offenbar der Kanal, der daran wesentlich beteiligt ist.
Molekular: Die Anionen-Selektivität von Claudin-17 wird durch eine positive Ladung der Aminosäure an Position 65 bestimmt.

Claudin-18
Lokalisation: Lunge, Magen, Oesophagus, Ohr: Cochlea, Corti-Organ, Stria vascularis Marginalzellen

Claudin-19
Lokalisation: Niere: Distales Nephron, Nerv: Schwann-Zellen
Funktion: Barriere

Claudin-20
Lokalisation: Auge: Retina-Pigmentepithel

Claudin-21

Claudin-22

Claudin-23
Lokalisation: Plazenta, Magen, Kolon-Tumore

Claudin-24

Claudin-25

Claudin-26

Claudin-27

Die TAMP-Familie
Generell: TAMP bedeutet Tight junction-Associated Marvel Proteins. Die TAMP-Familie besteht aus Occludin, Tricellulin und MarvelD3. Alle drei enthalten ein Transmembran-Motiv namens MARVEL (Myelin and lymphocyte And Related protein for VEsicle trafficking and membrane Link).

Occludin
Lokalisation: Alle Epithelien
Funktion: Occludin besitzt offenbar eine Barrierefunktion - dies ist aber schwierig nachzuweisen. Wenn es schon in der Embryonalentwicklung fehlt (Occludin-knockout-Modell), tritt keine Barriereveränderung auf, weil möglicherweise andere abdichtende TJ-Proteine dessen Funktion übernehmen. Bei Überexpression von Occludin kommt es jedoch eindeutig zu einer Verstärkung der Barrierefunktuktion.

Im Occludin-knockout-Modell traten morphologische Veränderungen der Drüsenzellen des Magenepithels auf: Hyperplasie der Mucuszellen und Verlust der Parietalzellen und demzufolge fast völliger Verlust der Magensäuresekretion. Occludin übt demnach bei der Differenzierung des Magenepithels eine regulatorische Funktion aus.

Wenig bekannt ist auch über die regulatorischen Mechanismen, die die Genexpression von Occludin beeinflussen. Wir versuchen deshalb, die in cis für die genomische Regulation der Tight junction bedeutsamen Sequenzen zu identifizieren und deren funktionelle Bedeutung bei der Zytokin-abhängigen Tight junction-Regulation zu erforschen.

Mittels Genome walking-Klonierung von Occludin-spezifischen menschlichen genomischen DNA-Sequenzen, haben wir ein 1853 Basenpaare langes DNA-Fragment gefunden, das einen Transkiptionsstartpunkt der Occludin-cDNA-Sequenz enthält, haben diesen amplifiziert und sequenziert.

Die proinflammatorischen Zytokine TNFa und Interferon-g verminderten die Occludin-Promoteraktivität jeweils allein und auch synergistisch im Sinne einer genomischen Regulation der Tight junction-Barriere. Beide Zytokine regelten die Expression von Occludin herab, während elektrophysiologisch eine Barrierestörung entstand. Somit könnte es sich hier um einen Mechanismus handeln, der bei Darmerkrankungen wie Colitis ulcerosa oder Morbus Crohn an dem entstehenden Barrieredefekt beteiligt ist.

Tricellulin
Lokalisation: "Dreiländer"-Eckpunkte von Epithelien = trizelluläre Tight Junction (tTJ)
Funktion: Fehlen von Tricellulin führt zu einer Störung der epithelialen Barriere. Tricellulin wurde von Shoichiro Tsukita entdeckt. Er starb am 10.12.2005 kurz vor Erscheinen seiner Pionierarbeit (Ikenouchi et al., 2005 [PubMed] [PDF]). Wir konnten zeigen, dass Tricellulin eine Abdichtung der trizellulären Junction gegenüber Makromolekülen bewirkt. Bei verminderter Tricellulin-Expression entsteht an der tTJ eine Durchtrittstelle für Makromoleküle. 

 

Gefördert durch:
  • DFG-Forschergruppe (FOR 721) "Molekulare Struktur und Funktion der Tight Junction" (Sprecher: Fromm)
    • TP1 "Charakterisierung von Tight Junction-Proteinen als Barriere- oder Kanalbildner" (Fromm, S.Amasheh)
    • TP7 "Renale Claudine und ihre Interaktionen" (Günzel)
    • TP8 "Tight Junction-Proteine als Regulatoren der Permeabilität des Perineuriums und der Antinozizeption perineural applizierter Pharmaka" (Rittner, Brack, Fromm)
    • TPZ "Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie" sowie Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie (Fromm, Schulzke, Krug)
    • Doktoranden der FOR 721
  • DFG-Sonderforschungsbereich (SFB 852), "Nutrition and intestinal microbiota - host interaction in the pig" (Sprecher: Zentek)
    • Projekt B2 "Paracellular intestinal barrier - effects of probiotics and feed additives" (Fromm, Schulzke)
  • DFG-Einzelförderung (AU 132/7-1 und AM 141/4-1) "Die Bedeutung von CD97 bei experimenteller Colitis und Colitis ulcerosa: Funktionelle Charakterisierung des Moleküls in intestinalen Epithelzellen" (Aust, S.Amasheh, Fromm)

 
The Tight Junctions
Lokalisation: Charité-events & Clubs in Berlin
Funktion: Darbietung von Classic Rock
Klinische Bedeutung: Motilitätssteigerung bei Beschallungsobjekten

Barrieredefekt bei Colitis ulcerosa und Morbus Crohn

Viele intestinale Erkrankungen beruhen nicht nur auf Störungen der epithelialen Resorption oder Sekretion, sondern, wie sich zunehmend herausstellt, auf Störungen der epithelialen Barriere.

Bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen Colitis ulcerosa und Morbus Crohn sowie bei der HIV-Enteropathie treten Diarrhoen auf, die in ihren Mechanismen bisher unbekannt sind. Durch Impedanz-Spektroskopie werden Ionenpermeabilitäten der Epithelzellschicht und des subepithelialen Gewebes getrennt, aber zerstörungsfrei bestimmt, so dass sich eine strukturelle Zuordnung von intestinalen Permeabilitätsstörungen zu den betroffenen Schichten der Gewebe ergibt.
Mit der Conductance scanning-Technik messen wir die flächige Geometrie von Permeabilitätsdefekten und korrelieren die Daten mit dem zugehörigen morphologischen Befund.

Eine pathologisch gesteigerte Ionenpermeabilität des Darmes kann eine Leckflux-Diarrhoe verursachen, die darauf beruht, dass Solute und Wasser massiv aus dem Blut ins Darmlumen übertreten.

Die Bedeutung der epithelialen Barrierefunktion liegt in immunologischer Hinsicht auch darin, dass eine intakte epitheliale Barriere das den Darm umgebende Gewebe vor luminalen Noxen schützt. Es wird diskutiert, dass durch eine Barrierestörung vermehrt Noxen und Antigene in die Darmwand eindringen und so den Krankheitsprozess unterhalten können.

Ob und wie Bakterien die Darmwand durchdringen können, haben wir unter definierten Versuchsbedingungen untersucht.

 

Entzündungsmediatoren TNFa und Interleukine

Als Entzündungsmediatoren wirkende Zytokine wie Tumornekrosefaktor alpha (TNFa), Interleukine und Interferon- werden bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und bei der HIV-Enteropathie lokal erhöht gefunden. Wir untersuchen daher die Effekte von Zytokinen auf den Transport und auf die Barrierefunktion von menschlichem Darm und von Kolon-artigen Zellkulturen (HT-29/B6).

Inzwischen werden Antikörper gegen Tumornekrosefaktor alpha (TNFa-Antikörper) auch klinisch bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen mit sehr gutem Erfolg eingesetzt.

Epitheliale Apoptosen verursachen Lecks

Stichwort: Epitheliale Apoptose

Nach herrschender Meinung bleibt während des Vorgangs der Apoptose der epitheliale Zellverband jederzeit abgedichtet. Dieses Dogma haben wir widerlegt, indem wir zum ersten Mal gemessen haben, dass spontan auftretende Apoptosen Lecks mit einer Leitfähigkeit von im Mittel etwa 50 nS verursachen. Die Messungen wurden mit der Conductance scanning-Technik an HT-29/B6-Monolayern durchgeführt:

Nach Induktion von Apoptosen mit dem Zytokin Tumor-Nekrosefaktor alpha (TNFa) waren die apoptotischen Lecks dramatisch verstärkt: Die Zahl der Apoptosen stieg um den Faktor 3 und die mittlere Leitfähigkeit der einzelnen Apoptosen stieg um den Faktor 12 auf 600 nS. Apoptosen verursachten dadurch mehr als die Hälfte des durch TNFa-induzierten Leitfähigkeitsanstieges; die andere Hälfte wird durch Degradation von Tight junctions in nicht-apoptotischen Bereichen verursacht.

Das bedeutet, dass spontane und erst recht durch Zytokine induzierte Apoptosen die epitheliale Barriere durchlöchern und auf diese Weise den Verlust von Soluten und die Aufnahme von Noxen begünstigen können.

In weiteren Studien wurde Apoptose durch den Topoisomerase-I-Inhibitor Camptothecin ausgelöst. Die Leitfähigkeitszunahme trat hierbei spezifisch nur an Apoptosen auf:

Direkte Messung der Durchlässigkeit des parazellulären Weges

In hoher Auflösung untersuchen wir mit der Conductance scanning-Technik die Ionenpermeabilität von epithelialen Schlussleisten (Tight junctions). Mit dieser und anderen Techniken wird untersucht, ob den mit Barrieredefekten einhergehenden Darmerkrankungen eine erhöhte Schlussleistendurchlässigkeit zugrunde liegt:

Förderung durch DFG Fr 652/4-2

 Wundheilung / Restitution epithelialer Einzelzelldefekte

Die epitheliale Barriere wird beim Verlust von Zellen, z.B. durch Verletzung oder durch Apoptose, beeinträchtigt und muss daher rasch repariert werden. Über die Reparatur größerer epithelialer Wunden (Restitution) ist schon viel bekannt. Dabei wird die Lücke durch Einwanderung intakter Nachbarzellen innerhalb von Stunden geschlossen. Tiefe Wunden erfordern zusätzlich Zellproliferation, so dass der Vorgang dann Tage in Anspruch nimmt. Auf der anderen Seite ist über den - viel schnelleren - Verschluss von Einzelzelldefekten sehr wenig bekannt. Eine rein morphologische Beobachtung kann nämlich nicht klären, ob das funktionelle Leck geschlossen wird. Dies ist aber mit der neuen Conductance scanning-Technik möglich. Wir untersuchen so zum Beispiel den Einfluss von Entzündungsmediatoren auf die Restitution von Einzelzelldefekten im Darmepithel.

Wurde gefördert durch DFG Graduiertenkolleg 276/2 "Signalerkennung und -umsetzung"

Lokalisierung von Ionenkanälen in Krypten und Oberflächenepithel

Mit der Conductance scanning-Technik in mittlerer Auflösung konnten wir in Krypten und Oberflächenepithel des Kolons die Ionenleitfähigkeiten für Na+, K+, Cl–, die durch apikale Kanäle für diese Ionen verursacht werden, messen.
So zeigte sich u.a., dass die für sekretorischen Diarrhoen (z.B. Cholera) bedeutsame cAMP-stimulierbare Sekretion von Cl– nicht nur - wie bisher angenommen - in den Krypten, sondern in gleichem Ausmaß auch in den Oberflächenepithelzellen lokalisiert ist:

Die durch Aldosteron induzierbare elektrogene Na+-Resorption dagegen ist auf das Oberflächenepithel beschränkt: 

Für die Lokalisation der K+-Sekretion ist entscheidend, wie sie ausgelöst wird: Bei Stimulation über den cAMP-Weg findet sich eine K+-Sekretion in Krypten sowie in Oberflächenepithelzellen, während sie bei Stimulation durch Aldosteron nur in den Oberflächenepithelzellen auftritt: 

Förderung durch DFG Fr 652/3-3

 Epithelialer Natriumkanal (ENaC)

Der Amilorid-blockierbare epitheliale Na+-Kanal (ENaC) ist das Schlüsselprotein für die Regulation des Na+-Haushaltes bei Wirbeltieren. Als limitierender Faktor der Resorption von Na+ in unterschiedlichen Organen besitzt er wichtige physiologische Bedeutung. Der ENaC wird in Epithelien des distalen Nierentubulus und des distalen Colons durch Aldosteron und andere Kortikosteroide reguliert:

ENaC besteht aus zwei a-, einer b- und einer g-Untereinheit [Kosari et al. 1998, J. Biol. Chem.; Firsov et al. 1998, EMBO J.]. Die Regulation des ENaC durch Aldosteron erfolgt nach jetziger Kenntnis auf genomischer Ebene. Der Ablauf gliedert sich in drei Phasen: Einer Latenzphase, einer Phase des Na+-Transport-Anstiegs und einer nach etwa 4 h einsetzenden Phase der Stimulation der basolateralen Na+/K+-ATPase [Benos et al. 1995, J. Membr. Biol.]. Entscheidend bleibt jedoch trotz der letztgenannten Phase die Regulation des epithelialen Na+-Kanals, da eine Blockade dieses Kanals durch das Diuretikum Amilorid den elektrogenen Na+-Transport (und damit die Wirkung von Aldosteron) vollständig hemmt [Benos 1982, Am. J. Physiol.].

Obwohl es als gesichert gelten kann, dass Aldosteron die elektrogene Na+-Resorption über einen transkriptionellen Regulationsmechanismus reguliert [Verrey & Beron 1996, NIPS], war lange ungeklärt, ob Aldosteron den elektrogenen Na+-Transport direkt durch Neusynthese von Kanalproteinen oder indirekt durch Induktion regulatorischer Proteine beeinflusst. Wir fanden hierzu folgendes:

Erstens konnte eine differentielle Regulation einzelner ENaC-Untereinheiten im distalen Colon der Ratte festgestellt werden. Hierbei unterschieden sich innerhalb des Colons das früh-distale (EDC) und das spät-distale Segment (LDC) erheblich. Im früh-distalen Segment trat nur ein geringer Natriumtransport auf. Die b- und g-Untereinheit wurden in diesem Segment hochgeregelt, während die a-Untereinheit konstant blieb. Dieser Befund war in voller Übereinstimmung mit der Literatur [Asher et al., 1996], die der a-Untereinheit eine konstitutive Rolle zuweist. Das spät-distale Colon erwies sich als dasjenige Segment, das den weit überwiegenden Anteil des Natriumtransportes aufwies. Überraschenderweise trat im spät-distalen Colon eine negative Regulation der a-Untereinheit durch Aldosteron auf transkriptioneller Ebene auf.

Zweitens zeigte sich, dass die bisher gültige Vorstellung, dass die Expression des ENaC nicht über direkte genomische Wirkung von Aldosteron erklärt werden kann [Barbry & Hofman, 1997], nicht haltbar ist. Diese Anschauung stammte aus dem Vergleich von Zeitverläufen der mRNA-Expression von ENaC-Untereinheiten mit aus der Literatur entnommenen Zeitverläufen des Natriumtransportes [Asher et al., 1996]. Unsere an identischen Geweben erhobenen Daten belegen dagegen, dass der Natriumtransport-Anstieg mehr als 1 Stunde nach dem Anstieg der b- und g-Untereinheiten-mRNAs auftritt, so dass der akute Effekt von Aldosteron durch direkte transkriptionelle Regulation der ENaC-Expression erklärt werden kann.

Die Expression von ENaC wird sowohl durch Mineralocorticoid-Rezeptoren (MR) als auch durch Glucocorticoid-Rezeptoren (GR) induziert. Die Expression wird von Butyrat und von Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) verstärkt.

ENaC wird bei entzündlichen Darmerkrankungen vermindert exprimiert. Dier Effekt wird durch pro-inflammatorische Zytokine wie Interleukin-1beta und Tumor-Nekrosefaktor-alpha (TNFalpha) vermittelt:

Frühere Arbeiten zum epithelialen Na+-Transport

Magnesium

Allgemeines zu Darmerkrankungen

Artikel "Kranker Darm: Hilfe und richtige Vorsorge" aus der Berliner Morgenpost, 23. 3. 2000,
Beiträge von Prof. Riecken, Prof. Buhr, Dr. Kroesen, Prof. Deter u.a.

 

cartoon
  Methoden 

Molekularbiologische Methoden

In den meisten Projekten bringen wir zunächst Epithelien unter elektrophysiologischer Kontrolle in einen definiert veränderten Funktionszustand und arbeiten dann diese Epithelian molekularbiologisch auf.

Die verschiedenen z.Zt. bearbeiteten Projekte lassen sich grob in 2 Gruppen einteilen:
1.  Der epitheliale Natrium-Kanal (ENaC)

2.  Tight junction-Proteine (Occludin und die Claudine)

Zur Untersuchung struktureller und funktioneller Eigenschaften der epithelialen Barriere werden Epithelzellverbände dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen unter den standardisierten Bedingungen der Zellkultur ausgesetzt. Während der Inkubationszeit werden die Veränderungen des transepithelialen Widerstands gemessen. Anschließend werden aus den Zellen RNA und Proteine isoliert, elektrophoretisch in einer Gelmatrix aufgetrennt und im Northern und Western Blot-Verfahren mit genspezifischen Sonden bzw. Antiseren gegen Tight Junction-Proteine analysiert.

Die dabei festgestellten Veränderungen in der Expression der untersuchten Biomoleküle lassen Rückschlüsse auf die Regulation der Genexpression und der Rolle der einzelnen Tight Junction-Proteine zu und führen letztlich zu einem besseren Funktionsverständnis der epithelialen Barriere. Neben den klassischen Hybridisierungsverfahren wenden wir moderne molekularbiologische Methoden zur strukturellen und funktionellen Analyse der parazellulären Barriere und der epithelialen Transportvorgänge an. Mit der Technik des Genome Walking ist es uns möglich, die strukturell mit dem Gen verbundenen regulatorischen Einheiten zu isolieren und nach Aufklärung der primären Nukleinsäuresequenz funktionell in Reportergenanalysen zu untersuchen.

Durch gezielte Mutationen können essentielle Bindungsmotive eingegrenzt und damit Rückschlüsse auf die mit der Regulation der Genexpression verbundenen Signaltransduktionskaskaden gezogen werden. Dies ist nicht zuletzt für die Weiterentwicklung von therapeutischen Ansätzen zur gezielten Behandlung chronisch entzündlicher Erkrankungen des Darmes von Bedeutung.

Fluoreszenzoptische Lokalisierung

Viele Moleküle können mit einem Immunfluoreszenzfarbstoff markiert werden und anschließend in einem konfokalen Laserscanning-Fluoreszenzmikroskop (CLSM) nachgewiesen und intrazellulär lokalisiert werden. Typische Anwendung: Nachweis, dass molekular in Membranfraktionen detektierte Tight junction-Moleküle tatsächlich innnerhalb Tight Junction lokalisiert sind und nicht etwa nur in der Nähe. Beispiel: Claudin-1 wurde mittels Western blotting in der Membranfraktion von MDCK-C11-Zellen nachgewiesen, was ungewöhnlich wäre, da MDCK-C11 ein eher leckes Epithelium bildet, Claudin-1 jedoch typisch für dichte Epithelien ist. Tatsächlich stellte sich heraus, dass Claudin-1 nicht mit Occludin in der Tight Junction colokalisiert, sondern unterhalb sitzt (s. Abb., nach Amasheh et al., 2002, J Cell Sci.):

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie der Tight Junction

Barriere- bzw. Permeabilitätseigenschaften der Tight Junction werden nicht ausschließlich durch ihre molekulare Zusammensetzung bestimmt, sondern auch - wie seit vielen Jahren bekannt - durch die ultrastrukturelle Anordnung, Ausdehnung und Kontinuität der Tight Junction-Strands. Zwischen der Ultrastruktur der Tight Junction und ihrer molekularen Zusammensetzung bestehen Wechselwirkungen. Zunächst wird mittels Gefrierbruch und Bedampfung ein Präparat erzeugt, das anschließend in einem Elektronenmikroskop untersucht wird. Die Bruchlinie liegt oft innnerhalb der lateralen Zellmembran und enthält somit manchmal typische Tight Junction-Strands. Diese werden vor allem hinsichtlich Zahl der horizontal liegenden Strands, ihrer Ausdehnung und dem Auftreten von Unterbrechungen morphometrisch analysiert.

Zur funktionellen Charakterisierung gastrointestinaler Epithelien in vitro und epithelialer Zellkulturen (Darm, Niere) werden elektrophysiologische Methoden benutzt. Im Prinzip können alle Gewebe oder Zellkulturen, die eine flächige Barriere von mindestens 3 mm Durchmesser ausbilden, untersucht werden.

Kurzschlussstrom und Widerstand in Ussing-Kammern

Klassische aber dennoch leistungsfähige in vitro-Standardtechnik zur pauschalen Bestimmung von aktivem Ionentransport (Kurzschlussstrom), Ionenpermeabilität (Leitfähigkeit bzw. Widerstand) und Radioisotopenfluxen. Drei Versuchsstände mit je 6 Kammern vorhanden [Fromm et al., 1993, Am. J. Physiol. 264: E68-E73, PDF].

Anwendung dieser Technik auch im Physiologiepraktikum für Mediziner mit Darmpräparaten aus einer Kaninchenschlachterei [Hegel et al., 1993, Am. J. Physiol. 265: S10-S19, PDF].

Wir haben 2 wesentlich aufwendigere Techniken entwickelt, mit deren Hilfe die lokale Leitfähigkeitsverteilung innerhalb des epithelialen Gewebes gemessen und zellulären bzw. subzellulären Strukturen zugeordnet werden kann:
- Conductance scannig erlaubt die Messung der horizontalen Leitfähigkeitsverteilung.
- Impedanz-Spektroskopie erlaubt primär die Messung der vertikalen, aber auch der horizontalen Leitfähigkeitsverteilung.

Conductance Scanning

Um die horizontale Verteilung der Ionenpermeabilität innerhalb eines Epithels quantitativ beschreiben zu können, haben wir eine neue elektrophysiologische Methode, Conductance scanning, entwickelt, die eine lokal begrenzte Messung epithelialer Leitfähigkeiten ermöglicht.

Die Methode beruht auf der Messung von lokalen Unterschieden der Stromdichte, die in der Elektrolytlösung über der mukosalen Oberfläche des flachen Epithels mit einem Mikroelekrodenpaar aufgezeichnet werden, während ein definierter Wechselstrom durch das Gewebe fließt. Mit mathematischen Modellen wird aus der supraepithelialen Stromverteilung die Leitfähigkeitsverteilung für das Epithel berechnet.

Wir haben die Methode für drei Anwendungsfelder entwickelt, die sich durch ihre Ortsauflösung und Berechnungsverfahren unterscheiden:

Ein-Wege-Impedanz-Spektroskopie (1PI)

Stichwort: Elektrische Impedanz von Epithelien

Getrennte, aber zerstörungsfreie Messung von epithelialer und subepithelialer Ionenleitfähigkeit an intestinalen Epithelien in vitro. Die Leitfähigkeit der Epithelzellschicht ist frequenzabhängig, die der unter dem Epithel befindlichen Gewebeschichten jedoch nicht (aufgrund der dort nicht vorhandenen tight junctions). Dies ermöglicht eine strukturelle Zuordnung von intestinalen Permeabilitätsstörungen zu den betroffenen Gewebeschichten. Eigene methodische Entwicklung. Zwei Versuchsstände vorhanden.

Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie (2PI)

Eine aktuelle Weiterentwicklung stellt die Zwei Wege-Impedanzspektroskopie dar. Sie dient der Bestimmung von parazellulärem und transzellulärem Widerstand an epithelialen konfluenten Zellkulturen. Eine spezifische Perturbation eines der beiden Wege ermöglicht die Erfassung zweier Datensätze, die zusammen mit der Permeabilitätsmessung für einen geeigneten parazellulären Marker eine Berechnung der Widerstandswerte der beiden Wege ermöglicht.

Methode:

Anwendungen:

Patch-Clamp

Bestimmung von Leitfähigkeit, Spannungsabhängigkeit und Offen-Wahrscheinlichkeit von Kanälen der Zellmembran. Weit verbreitete elektrophysiologische Methode, daher hier keine weitere Darstellung.

Hinweis: Dr. Friederike Stumpff organisiert das Berliner Patch Clamp-Colloquium mit Teilnehmern aus der gesamten Patch clamp-Landschaft Berlins.

cartoon
  Einige Begriffe 

Epithelien

bilden Grenzflächen des Körpers zwischen der funktionellen Außenseite (zumeist Lumina epithelialer Organe) und dem Interstitium. Ihre beiden Hauptfunktionen sind, sieht man von Sinnesepithelien ab, zum einen der transepitheliale Transport in resorptiver oder sekretorischer Richtung und zum anderen die Bildung einer Barriere zwischen innerem und äußerem Kompartiment.

Durch das geregelte Zusammenspiel beider Funktionen sind Epithelien in der Lage, eine unterschiedliche Zusammensetzung der Kompartimente zu erzeugen und aufrecht zu erhalten. Während die Bedeutung der Transportfunktion zum Beispiel im Gastrointestinaltrakt evident ist, wurde die Barrierefunktion in ihrer Bedeutung früher oft unterschätzt. Der Abdichtungsgrad der epithelialen Barriere ist nicht nur in verschiedenen Epithelien sehr unterschiedlich ausgeprägt, sondern es ist inzwischen vielfach gezeigt worden, dass die Abdichtung durch intrazellulär vermittelte Regulation auch variiert werden kann.

Besondere pathophysiologische Bedeutung erlangt die Barrierefunktion dadurch, dass sie z.B. bei einer Reihe von Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes verändert ist und schwerwiegende Krankheitssymptome verursachen kann.

Die Zellinie HT-29/B6

Die hochdifferenzierte Zellinie HT-29/B6 haben wir aus der humanen Colon-Carcinom-Linie HT-29 entwickelt [Kreusel et al., 1991].

HT-29/B6-Zellen wachsen auf Filtermembranen als epitheliale Monolayer. Auf Sekretagoga reagieren sie mit Chloridsekretion und produzieren Mukus [Epple et al., 1997]. Sie bilden apikal einen Bürstensaum aus und weisen komplette tight junctions auf [Schmitz et al., 1999]. Sie besitzen epitheliale Barriereeigenschaften, die für Colon-Cryptenzellen charakteristisch sind [Gitter et al., 2000] und können zu Einzelzellapoptosen veranlasst werden [Bojarski et al., 2001]. Die Zellinie HT-29/B6 ist ein vielfältig anwendbares und gut charakterisiertes Modellepithel für die Untersuchung intestinaler Funktionen.

Leckflux-Diarrhoe

Diarrhoe (Durchfall) kann durch folgende Mechanismen verursacht werden [Fromm, 1994]:

Die Leckflux-Diarrhoe wird durch eine epitheliale Barrierestörung verursacht. Ursache ist fast immer eine ungenügende Abdichtung der Tight junctions; dadurch können gelöste Stoffe und Wasser ins Lumen zurückströmen (Leckflux) und werden in der weiteren Passage nicht mehr resorbiert.

Beispiel: Cholera-Toxin verursacht eine schwere sekretorische Diarrhoe (über 5 Liter pro Tag). Bei dem Versuch, einen gegen Cholera wirksamen Impfstoff herzustellen, wurde ein Stamm, CVD101, geschaffen, der keine sekretorische Diarrhoe verursacht. Erstaunlicherweise verursachte dieser Stamm ebenfalls eine Diarrhoe mit einem Stuhlvolumen von immerhin 1 Liter pro Tag [Levine et al., 1988]. Es zeigte sich, dass CVD101 die Epithelleitfähigkeit stark erhöht. Zugleich waren die tight junctions in ihrer Struktur beeinträchtigt [Fasano et al., 1991]. Dies bedeutet, dass eine Diarrhoe allein durch einen Barrieredefekt der tight junctions ausgelöst werden kann.

Ausführliche Darstellung:  Apoptose im Kolonepithel

Ausführliche Darstellung:  Elektrische Impedanz von Epithelien: Impedanz-Spektroskopie